各种电生理记录技术的发展不断加深我们对行为和认知神经学的研究。例如，可植入的探针，如硅基或聚合物多电极阵列，具有高电极密度，可以检测高信噪比（SNRs）的单个神经元的活动，在提高对神经元网络的理解方面发挥了重要作用；然而，植入式探针的侵入性会损伤脑组织，由于长期的胶质细胞增生而产生不稳定的记录。由于植入式探针不可避免的损伤问题，表面电极阵列（SEAs）或皮质电图（ECoG），最近受到了越来越多的关注。由于SEAs被直接放置在组织或大脑表面，无需物理干预来询问神经系统，相关的手术方法很少导致炎症反应。

因此，低杨氏模量和低弯曲刚度在定义机械失配方面起着至关重要的作用，是合理设计SEAs的关键考虑因素。一般来说，SEAs由三个主要组成部分组成：(1)检测神经信号的记录电极，(2)将检测到的信号传输到外部接口的互连接器，以及(3)封装互连接器的钝化层，以确保它是电隔离的。导电金属如铂、铱和氧化铱由于其良好的离子转移到神经组织而被广泛用于记录电极。对于互连器，Au薄膜由于其稳定性和制造可行性而被普遍使用。此外，为了实现良好的组织-器件界面，已经开发了聚酰亚胺、聚二甲基硅氧烷（PDMS）、SU-8等软材料，用于钝化层。

尽管表面电极阵列具有这些优势，但仍然存在一些关键问题亟待解决。首先，使用水凝胶等软材料实现开放式网格结构是困难的。特别是，水凝胶具有带电骨架并在水中膨胀，需要额外的绝缘层。其次，在水凝胶上准确印刷并制造金属互连对于表面电极阵列而言是具有挑战性的。第三，尽管金属薄膜的互连在基于软材料的表面电极阵列中通常被使用，但它们显著增加了器件的杨氏模量。在这种情况下，要在保持器件柔韧性的同时增加电极数量是一项挑战。最后，软材料的整体厚度通常在几到数十微米之间，这使得它们不太适合在曲线脑表面上进行符合部署。由于这样厚的探针会增加神经元与探针之间的距离，突出了表面电极阵列的缺点，即记录空间分辨率低的弱神经信号。

为了解决这些问题，我们开发了一种超薄的表面电极阵列神经探针（“NeuroWeb”），由硼氮化物（h-BN）和石墨烯（Gr）组成，充分利用了多电极可植入阵列 (iMEAs) 单元间尖峰检测能力和表面电极阵列 (SEAs) 的微创性优势。总厚度约为100纳米的开放式网格结构允许在活体小鼠大脑表面检测到高质量的神经信号，形成符合且紧密的界面。通过柔韧性和粘附实验，对这种微创性探针的改进机械特性进行了评估。我们还展示了具有高密度电极的垂直堆叠以进行多路复用的可能性。此外，与1μm厚的聚合物-金属表面电极阵列相比，我们的探针显示出尖峰幅值和检测到的神经元数量显著增加，同时具有优异的可见光透过率。此外，使用双重NeuroWeb进行光遗传学实验，实现了从中枢神经系统 (CNS) 两个不同区域，即体感皮层和小脑，同时记录神经信号。我们相信NeuroWeb代表了一种独特类型的神经探针，能够以高空间和时间分辨率进行大脑表面的光学和电生理映射。

设计与加工

NeuroWeb是一种微创的神经探针，可以检测活体小鼠大脑表面的神经元动作电位（见图1a）。NeuroWeb由活动区域、支撑区域和金属互连的开放式网格结构组成，具有不同的功能。首先，活动区域包含32通道的铂电极，这些电极与夹在顶部和底部h-BN绝缘层之间的石墨烯线相连接（见图1b）。铂电极从开放式网格结构中暴露出来，用于神经元检测。顶部的SU-8层增加了活动区域的机械强度。这个由SU-8/h-BN/Gr/h-BN组成的活动区域设计厚度为100纳米。其次，支撑区域由SU-8/Au/SU-8开放式网格结构组成，允许活动区域展开而不会纠缠在一起。借助支撑区域的强度，活动区域可以无褶皱地附着在脑表面上。第三，金属互连由金线电连接石墨烯线和输入/输出(I/O)垫。I/O垫最终连接到外部记录仪器。支撑区域和金属互连的厚度约为1μm。Gr和h-BN的厚度分别为几纳米和数十纳米，这取决于层的数量；因此，可以实现超薄的NeuroWeb，展现以下可能性。首先，随着厚度减小，弯曲应变线性减小，非弹性材料变得更加柔韧，因此NeuroWeb甚至可以牢固附着在起伏不平的表面上。其次，NeuroWeb的改进柔韧性和粘附性增加了电极和脑组织之间的接触面积，使神经信号的检测更加高效。第三，由于NeuroWeb的透明性，神经活动的荧光图像可以在不阻碍视野的情况下进行光学实时监测和捕获。第四，可以进行精心设计的光遗传学实验，监测跨多个脑区的复杂神经通路。第一步，为了评估利用多层h-BN作为合理探针设计的封装层的可行性，我们测量了覆盖了约30纳米厚的多层h-BN的石墨烯线的I-V特性，通过单通道或交叉通道配置进行测量，在带有磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)溶液和不带PBS溶液的情况下(图1c)。当在h-BN层上方放置PBS溶液时（图1c中的红点），只观察到从约390 nA增加到约500 nA的微不足道的电流泄漏，同时也没有测量到频率依赖性。这个测量结果表明h-BN可以作为神经探针中的有效封装层。

电极的柔顺性、粘附强度和堆叠性

对NeuroWeb的机械特性，包括柔韧性和粘附性进行了系统研究，以评估该探针是否能够与不规则表面形态密切贴合。首先，在柔韧性实验中，我们在镀金膜基底上制备了周期性的SU-8线条图案，宽度为10μm，高度为5μm，间距从50到80μm不等，并将NeuroWeb转移到基底上（图2a）。为了比较，还将标准的聚合物-金属SEA(SU8-Au SEA)转移到了同一基底上（图2b）。

如SEM图像所示（图2c），NeuroWeb沿着间距从50到80μm的SU-8结构弯曲，并且记录电极牢固地附着在镀金基底上。然而，由于相对较厚的SU-8层和嵌入SU-8中的硬朗Au互连，SU8-Au SEA的电极未能接触到基底（图2d）。这些结果可以通过测量电极与镀金基底之间的电阻来进行定量分析（图2e）。随着间距d的增加，在NeuroWeb的情况下，电阻从195.4降至47.4 kΩ。由于NeuroWeb具有显著的柔韧性，记录电极与包含障碍物的镀金基底表现出高效的电气接触，并测得低电阻。相比之下，SU8-Au SEA显示为无穷大的电阻。

NeuroWeb电极在活鼠脑表面进行电生理记录

为了检测小鼠大脑表面的动作电位，电极被放置在皮层表面，去除颅骨（~3×3mm²）和硬脑膜后。电极的I/O部分通过直接接触方法与柔性平板电缆（FFC）电连接，用于从32个铂记录电极传输信号到外部接口（图3a）。放大的光学显微镜图像显示整个活跃区域与小鼠大脑表面呈无皱折粘附，直径约2毫米（图3b）。BN-Gr带的卓越透明度使得能够清晰地观察到活跃区域。只有铂记录电极可见于大脑表面（白色箭头，图3c）。

NeuroWeb电极的光学特性和电生理分析

为了更量化地评估NeuroWeb的独特特性，例如活跃区域的高透明度和神经信号的稳健检测能力，我们将其与厚度约为1微米的标准聚合物-金SEA（SU8-Au SEA）进行了比较。为此，将神经Web或SU8-Au SEA放置在活体小鼠的大脑表面上（图4a）。这两种探针的光学图像呈现出非常不同的特征（图4b）。透明的神经Web下清晰可见大脑表面，而SU8-Au SEA下则密集的金线使得大脑表面不可见。

双光刺激神经回路的研究

基于我们的研究，NeuroWeb是否能够检测大脑更多皱褶区域的神经活动，并解析跨大脑区域的复杂神经回路。作为概念验证，我们使用具有光学刺激的双重NeuroWeb，研究了体感皮层（S1）（ML: 3.4，AP: -2.3，DV: 1.1）和小脑（Cb）（ML: 0，AP: -6.3，DV: -0.9）之间的神经连接。NeuroWeb A和B分别连接到表达ChR2和黄色荧光蛋白（Thy1-ChR2-YFP）的转基因小鼠的S1和Cb上，以记录488 nm激光刺激S1或Cb所引发的神经信号（图5a）。在手术期间，从S1和Cb上小心移除颅骨和硬脑膜，以便安装两个NeuroWeb（图5b）。我们注意到Cb有许多褶皱，使其呈现出褶皱的外观。每个NeuroWeb通过直接接触法与相应的32针FFC（FFC-A或FFC-B）电连接，光纤耦合激光二极管用于选择性刺激S1和Cb（图5c）。在这个实验中，我们进行了多细胞刺激，以研究S1和Cb不同中枢神经系统区域的光学诱发神经活动和神经回路。

结论

总的来说，我们的NeuroWeb是迄今为止开发的最薄的神经探针之一，并在灵活性、附着力和透明性方面表现出独特的特点。由于其超薄的厚度和开放式网格结构的合理设计，NeuroWeb展现出与植入式探针相当的出色电生理性能，能够在不穿透大脑组织的情况下，显示出高幅度和信噪比的单位脉冲。我们还提出了一种有效的垂直堆叠多路复用方法，以增加电极密度，同时保持设备的灵活性，而无需依赖光刻分辨率。此外，NeuroWeb的出色透明性（接近100%的透射率）和强附着力被充分利用，以便通过光遗传学实验发现Cb和S1之间的神经相关性。